Microorganismos asociados a Pudrición basal en cultivos de Piña

Study Extent

Cultivos de Piña MD2 en el departamento del Valle del Cauca.

Sampling

Se colectaron en total 316 muestras de hojas de plantas con síntomas de pudrición basal y 316 muestra del suelo en cinco municipios, Dagua, Restrepo, La Cumbre, Buga y Palmira del departamento del Valle del Cauca. Las muestras fueron llevadas al laboratorio de Fitopatología de Agrosavia C.I. Palmira para su procesamiento. A partir de las muestras de material vegetal se obtuvo un total de 163 aislamientos: 95 aislamientos corresponden a Oomycetes, 36 a bacterias y 32 a hongos. Se realizó registro de los aislamientos obtenidos con información relevante de origen, se codificaron en consecutivo con ID desde MPB01 hasta MPB316 según la codificación de la muestra vegetal correspondiente y se almacenaron en medio de cultivo PDA+/BNPHRA (Oomycetes), PDA (hongos) y AN (bacterias). La caracterización morfológica de los aislamientos permitió determinar que los 95 aislamientos de ooymicetes corresponden al género Phytophthora sp. Adicionalmente, se seleccionaron 7 aislamientos de bacterias por sus propiedades similares a las bacterias fitopatógenas de la familia Enterobacteriaceae, de las cuales se debe confirmar si pertenecen al género Dickeya sp. y 14 aislamientos que correspondieron al género Fusarium sp.

Quality Control

Caracterización morfológica de los aislamientos de hongos y oomycetes. Caracterización bioquímica de los aislamientos de bacterias.

Method steps

1. Caracterización morfológica de aislamientos bacterianos. Se realizó siembra de cada aislamiento bacteriano en medio agar nutritivo (AN) de colonias puras obtenidas por agotamiento, con el fin de realizar la caracterización morfológica mediante pruebas bioquímicas, cada cepa estaba en crecimiento activo (entre 24 a 48 horas) con el fin de ejecutar inicialmente las pruebas de tinción de Gram y test de solubilidad KOH. A las cepas identificadas como Gramnegativas se les realizó las prubas adicionales: test catalasa, test oxidasa, test ureasa, crecimiento anaeróbico (Hugh and Leifson), crecimiento a 37ºC, formación de Pits en medio CVP. Cada una de las pruebas se realizó por duplicado para cada uno de los aislamientos, la identificación hasta familia de los aislamientos bacterianos se realizó teniendo en cuenta las características metabólicas obtenidas en cada uno de los tests con ayuda de las claves de Shaad (2001) y Goszczynska et al. (2000).
2. Caracterización morfológica de los aislamientos de hongos. La caracterización morfológica de los aislamientos presuntivos al género Fusarium se realizó a nivel macroscópico y microscópico. Se identificaron dos características macroscópicas principales de las colonias: velocidad de crecimiento y pigmentación, la determinación de estas dos características se realizó a partir de los cultivos monospóricos. Para la velocidad de crecimiento se realizó una siembra de cada aislamiento en medio PDA y su crecimiento fue medido diariamente por espacio de 8 días, los aislamientos se mantuvieron en oscuridad a 25°C durante el lapso de tiempo que duraron las mediciones; se determinó la tasa de crecimiento radial [Tc (mm/día) = (Cf-Ci) / (TF-Ti)] comparando el crecimiento en el octavo día (Cf) menos el crecimiento inicial (Ci) dividido por el tiempo final (Tf) menos el inicial (Ti); los aislamientos se agruparon considerando las categorías de crecimiento lento (<10 mm /día), medio (10 -12 mm/día) y rápido (> 12 mm/día). En cuanto a la pigmentación de la colonia, se realizó la toma de color teniendo como referencia la tabla de colores Munsell para tejidos vegetales. La toma de color se realizó tanto en el anverso como en el reverso de cada una de las colonias registrando las tonalidades que presentaron las cepas. Con el fin de realizar la caracterización microscópica, cada aislamiento monospórico fue sembrado en diferentes medios de cultivo tales como agar suelo (SA) para formación de clamidosporas, medio Spezieller Nährstoffarmer Agar (SNA) para la formación de microconidias y finalmente para obtener macroconidias y sus agurpaciones en esporodoquios se utilizó medio agar hojas clavel (CLA); los aislamientos se incubaron a 25°C en oscuridad, las observaciones de las estructuras se realizaron en un lapso de 10 a 12 días después de la siembra por medio de montajes en portaobjetos tiñendo el micelio con azul de lactofenol para observación al microscopio. La identificación de los aislamientos hasta género se realizó teniendo en cuenta las características de sus estructuras con ayuda de las claves taxonómicas de Leslie & Summerell (2006).
3. Caracterización morfológica de los aislamientos de Oomycetes. La caracterización morfológica de los aislamientos de Oomycetes se realizó a nivel macroscópico y microscópico. Se establecieron dos características macroscópicas principales: velocidad de crecimiento y patrón de crecimiento del micelio, la determinación de estas dos características se realizó a partir de los cultivos puros de monomicelio. Para la velocidad de crecimiento se realizó una siembra de cada aislamiento en medio PDA y su crecimiento fue medido diariamente por espacio de 10 días, los aislamientos se mantuvieron en oscuridad a 25°C durante el lapso de tiempo que duraron las mediciones; se determinó la tasa de crecimiento radial [Tc (mm/día) = (Cf-Ci) / (TF-Ti)] comparando el crecimiento en el octavo día (Cf) menos el crecimiento inicial (Ci) dividido por el tiempo final (Tf) menos el inicial (Ti); los aislamientos se agruparon considerando las categorías de crecimiento lento (<10 mm /día), medio (10 -12 mm/día) y rápido (> 12 mm/día). Al terminar las mediciones de crecimiento de micelio, se determinó la morfología de la colonia de cada uno de los aislamientos según su patrón: uniforme, radial, estrellado, petaloide/rosetado y sin patrón.
4. Para la caracterización microscópica, cada aislamiento se sembró en agar 10%V8 y se incubó a 25ºC por tres días, posteriormente se indujo la esporulación de las cepas sembrando plugs de 5 mm2 de estas colonias con crecimiento activo en agua destilada estéril y en agar agua (AA) incubándolas a 25ºC con luz fría fluorescente; se realizaron las observaciones montando parte de micelio en portaobjetos y observando en microscopio la presencia de estructuras a 10x, 40x y 100X. La morfología de los esporangios fue determinada según su forma, tamaño, papilación y morfología del esporangióforo. También se determinó la presencia o ausencia de clamidosporas así como su diámetro. La identificación de los aislamientos de Oomycetes hasta género se realizó teniendo en cuenta las características macro y microscópicas de las colonias y sus estructuras, con ayuda de las claves taxonómicas de Erwin & Riberio (1996), Drenth, A., & Sendal, B. (2001) y Galley & Hong (2008).
5. Preservación de aislamientos bacterianos. Los aislamientos bacterianos fueron preservados por duplicado en tubos con agar nutritivo cubiertos con aceite mineral estéril (glicerol) y se almacenaron a 4ºC (Shaad, 2001). Preservación de aislamientos de Fusarium sp: Se realizó la preservación de los cultivos puros y monospóricos mediante crecimiento de los aislamientos en medio PDA con papelillos estériles, cuando éstos fueron colonizados se realizó el secado de los mismos por 24 horas en cabina de flujo laminar y se almacenaron en sobres estériles a 4°C (García & Uruburu, 2000). Preservación y mantenimiento de aislamientos de Phytophthora sp: Se almacenaron los aislamientos en viales con agua destilada estéril, se cortaron con ayuda de un sacacorchos plugs de 0,5 mm2 de un cultivo puro activo en medio PDA , colocando de 3 a 5 plugs en cada vial. Los aislamientos una vez almacenados de esta manera, deben ser activados una vez al año para su mantemiento (Drenth & Sendall, 2001).
6. Metodología de Identificación molecular: para la caracterización e identificación molecular se extrajo el ADN de los nueve (9) registros (aislamientos) y se llevó a cabo la amplificación por PCR de la región ITS utilizando el par de cebadores ITS4 e ITS6. Se visualizaron las bandas esperadas de aproximadamente 900 pb y se secuenciaron los productos amplificados. Las secuencias se editaron y alinearon utilizando el software GENEIOUS Prime 2022.2.1. La identidad de nucleótidos se determinó utilizando BLASTn (NCBI). Los resultados mostraron que los aislamientos compartían una identidad superior al 99% con los aislamientos notificados de Phytophthora nicotianae. Las nueve secuencias consenso de 858 pb obtenidas en este estudio se depositaron en GenBank con los números de acceso entre OQ076297 y OQ076305 donde pueden ser verificadas y validar su identidad con la especie mencionada. También se construyó un árbol filogenético utilizando el método de máxima verosimilitud con las secuencias de los nueve (9) aislamientos, utilizando la secuencia de la cepa MG865550 ex-type de P. nicotianae como referencia y once (11) secuencias de otras especies que pertenecen al clado 1 y seis (6) secuencias de P. nicotianae depositadas en GenBank obtenidas en cultivos de piña en todo el mundo. El árbol se construyó en base a 1000 bootstraps utilizando el software MEGA 11. Las accesiones de referencia se distribuyeron en los cuatro subclados reportados (1a, 1b, 1c y 1d) y las secuencias de los nueve (9) aislamientos de microorganismos asociados a las pudriciones basales en el cultivo de piña pertenecientes a la colección del Banco de Germoplasma de Microorganismos - AGROSAVIA se agruparon con la secuencia de la cepa tipo dentro del subclado 1d reportado para Phytophthora nicotianae.

Microorganismos asociados al cultivo de la piña: Bacterias, Oomycetes, Hongos.

1. Phythophthora
   rank: genus
2. Fusarium
   rank: genus
3. Enterobacteriaceae
   rank: family

Departamento del Valle del Cauca, municipios de Dagua, La Cumbre, Restrepo, Vijes, Buga y Palmira.