Expediciones en biodiversidad alrededor del Cacao en la zona de Caguán-Caquetá, proyecto Colombia Bio

Study Extent

La priorización de la Expedición Cacao Colombia Bio basados en criterios de modelación, expediciones previas, colecciones históricas y recomendaciones de expertos en los diferentes componentes de estudio. Las zonas de colección son Caguán, Caquetá y Putumayo, consideradas parte del centro de origen de cacao silvestre y conocido también como centro de producción de nuevas especies. El estudio de esta zona clave para entender el origen y la evolución del cacao colombiano. En este estudio se realizaron 11 muestreos en ocho localidades llevados a cabo del 16 de julio al 05 de agosto de 2018.

Sampling

En cada una de las parcelas se llevó a cabo el marcaje de una parcela de 500 m2 alrededor de un árbol central de Theobroma sp. que fuese dominante, habitualmente de gran porte. En estas parcelas se registraban todas las especies botánicas que componían el bosque asociado a Theobroma sp. para su caracterización. Dentro y en los alrededores de cada parcela se realizaba la búsqueda de árboles de los Géneros estudiados de menor porte para la toma de muestras entomológicas de fitopatógenos. Adicionalmente se realizó el estudio del componente insectos, microbiota y fitopatógenos. Las muestras serán depositadas en el Museo de Historia Natural C.J. Marinkelle de la Universidad de los Andes y la Colección Taxonómica Nacional de Insectos “Luis María Murillo” de AGROSAVIA.

Method steps

1. Componente plantas -Subcomponente Plantas-Bosques: 1. Identificación de la especie de Theobroma: Se identificarán arboles de los géneros Theobroma y Herrania teniendo en cuenta las características botánicas de estos géneros y con ayuda del experto en flora local y el equipo de botánica de la expedición. La metodología a utilizar será recorridos por transectos y búsqueda de individuos por observaciones visuales dentro del bosque. Aclaración 1: En caso de encontrar diferentes individuos de la misma especie se georreferenciará el árbol más dominante (mayor DAP) y sobre este se realizará el trazado de la parcela circular. Aclaración 2: En caso de encontrar dos individuos de diferentes especies de interés para la expedición, se tomará cada especie como centro de parcela y se levantará dos parcelas independientes; en caso de cercanía de los individuos de interés y se traslapen las dos parcelas, para términos de recolección de información se levantarán las dos parcelas en planillas diferentes. 2. Establecimiento de Parcela Circular PC (Murillo, 2009): cada parcela circular fue de 12,62 m de radio y una superficie de 500 m2. El objetivo de esta parcela circular es tomar como eje central el espécimen de interés y levantar la información de las especies circundantes para evaluar una posible interacción con el espécimen de interés, para el montaje de la PC y el levantamiento de la información con las siguientes actividades: -Se ubicó el centro de la PC, tomando como referencia el espécimen de interés de la expedición, se marcó con una plaqueta con el código de la CBC-01 (Cacao Bio Caquetá 01). - Se georreferenció el espécimen central de la parcela. - Identificación de cuadrantes, marcado de los ejes (X – en dirección oriente - occidente) y (Y en dirección Norte - Sur). - Desde el centro de la PC y con la ayuda de una cinta métrica se trazaron líneas de 12,62 m hacia los cuatro puntos cardinales (eje X en sentido oriente-occidente y eje Y norte-sur) y su intermedio (45º, 135º, 225º, 279º), estacando y/o señalizando el lugar donde termina. En la medición de estas distancias se debe tener en cuenta la correcta medición de distancias en pendientes. - Se proyectó una circunferencia enmarcada dentro de las líneas establecidas identificando los árboles que quedan dentro. Variables medidas: - DAP+10 cm (Toda la parcela) - Altura total HT. - Altura comercial HC. - Circunferencia tallo (1.3 m- DAP ó CAP) - Distancia en metros (m) del individuo con base a los ejes centrales (Distancias Eje X y Y), diferenciando el cuadrante en el que se ubica. - Diámetro de copa en metros, (X-Y), cuando es irregular se toman tres medidas. - Individualización Subcomponente Plantas-Genética Se colectaron 3 ejemplares de cada morfoespecie, en lo posible en estado fértil. Estos ejemplares se secaron, montaron y se depositaron en el herbario de la Universidad de los Andes. De cada ejemplar, se tomaron muestras que se disecaron en sílica gel para poder extraer el material genético y generar el código de barras de ADN. Subcomponente Plantas-Geografía Como complemento al método de muestreo por parcela, y con el fin de aumentar nuestro conocimiento sobre la distribución y composición de las especies de Theobroma y Herrania en los sitios de las expediciones CacaoBIO se estableció un muestreo libre en las zonas de los alrededores de las parcelas. La forma como se llevaron a cabo estos muestreos libres fue bajo el método de colecta botánica tradicional y procedimientos de posterior análisis y divulgación científica de los resultados. Los siguientes pasos fueron aplicados: 1) búsqueda del mayor número de especímenes en los diferentes paisajes. 2) colecta de ramas, frutos y flores en los casos que se encontraran disponibles. 3) geolocalización con GPS de cada muestra. 4) procesamiento en húmedo de la muestra para ser parte de la colección de herbario de la Universidad de los Andes. 5) uso de los datos de GPS para mapear la distribución de las colecciones para los géneros Theobroma, Herrania, e igualmente T. cacao silvestre. 6) análisis de la información geográfica para la generación de un artículo científico sobre la distribución y diversidad de las especies colectadas durante las expediciones en el contexto de los registros históricos nacionales.
2. Componente insectos Colecta de insectos fitófagos y enemigos naturales asociados al estrato arbóreo de cacao: Los artrópodos presentes en la copa de los árboles de Theobroma cacao fueron colectados mediante tres metodologías complementarias ampliamente utilizadas para la colección de artrópodos sobre árboles en ecosistemas tropicales. Las técnicas de vareo de ramas, uso de manga entomológica y colección manual de artrópodos. Vareo: En cada punto de colección se tomaron un mínimo de 10 muestras de vareo correspondientes a diferentes árboles focales. En cada árbol se seleccionaron cuatro ramas de tamaño similar (una por punto cardinal) que fueron golpeadas con un báculo acolchado para hacer caer los artrópodos presentes en la rama sobre una bandeja de vareo consistente en una superficie de 60 × 60 recubierta por una tela inclinada hacia el centro. En el punto central de la bandeja los artrópodos fueron recogidos en un recipiente que contenía etanol al 70% para su conservación. Una muestra consistió en los artrópodos colectados de las cuatro ramas por árbol. En el laboratorio, se realizó una limpieza y separación de los artrópodos de los restos vegetales bajo estereoscopio. Los artrópodos fitófagos, depredadores, y parasitoides obtenidos fueron separados e identificados al máximo nivel taxonómico posible mediante claves entomológicas. Manga entomológica: Este muestreo se apoyó al vareo mediante el uso de manga entomológica sobre la vegetación a la misma altura que el vareo. Los insectos recogidos en la manga entomológica fueron retirados de la manga y pasados manualmente a viales que contenían etanol al 70%. La transferencia se realizó sobre la superficie de la manga entomológica para evitar la pérdida de material. Colecta manual: Basada en la inspección visual de la parte alta de la vegetación (el árbol) como se describe en Coddington durante un periodo de una hora/persona por árbol focal de muestreo (Coddington et al., 1991). Colecta de insectos polinizadores de cacao: Los insectos polinizadores de cacao, reconocidos y comúnmente muestreados pertenecientes a la familia Ceratopogonidae (Arnold et al., 2018) fueron colectados en cada punto de muestreo mediante trampeo y succión con aspirador de mano o “pooter”. Estas metodologías están basadas en las propuestas por Frimpong para el muestro efectivo de polinizadores de cacao (Frimpong et al., 2009) Trampeo: En cada árbol focal de muestreo, fueron colgadas cuatro trampas de agua pintadas con pintura especial de brillo ultravioleta de color amarillo. Las trampas, de 15 cm de diámetro aproximadamente, serán llenadas hasta tres cuartos de su capacidad con agua jabonosa para asegurar que los insectos atraídos sean capturados. Tras 24 h se procedió al filtrado de su contenido conservando los insectos capturados en viales con etanol del 70%. Succión: Este método de muestreo se llevó a cabo dependiendo de la disponibilidad de flores. En el árbol focal se seleccionarán ramas con una alta cantidad de flores en una sección de un metro (a partir de 10 flores preferiblemente) a una altura máxima de 1,3 m. Esta sección del árbol será marcada para realizar la succión de insectos visitantes de flores de cacao con un aspirador de insectos mecánico (Watkins & Doncaster, 1874). El muestreo se llevó a cabo en las horas de máxima actividad de polinizadores de 7.00 a 12.00 aspirando todas las flores de la sección dos veces en un periodo de 10 min. Los insectos colectados fueron puestos en contacto con un algodón conteniendo etanoato de etilo y posteriormente conservados en etanol al 70%. En laboratorio se realizó una identificación a nivel de género siguiendo claves taxonómicas. Para la identificación a nivel de especie se acudió a taxónomos especialistas en el grupo.
3. Componente Microbiota Con el fin de determinar la composición microbiana asociada a raíces, hojas, ramas, cojines florales y frutos de Theobroma cacao y especies hermanas, se realizó la extracción de ADN de estos tejidos y la amplificación de marcadores moleculares (16S rARN e ITS). Se colectaron hojas, frutos, troncos, ramas y raíces (5 g de cada muestra en falcon de 50 ml estériles) y se almacenaron a -80 °C en nitrógeno líquido hasta su procesamiento. A partir de las muestras recolectadas, se realizaron extracciones de ADN mediante el uso del kit comercial PowerSoil® DNA Isolation Kit. El ADN obtenido de cada muestra fue cuantificado con NanoDrop™ 2000, obteniendo su concentración y verificando la calidad con los índices 260/280 y 260/230. La clasificación taxonómica y la evaluación de la diversidad de la comunidad se realizó por medio de la secuenciación masiva de los siguientes marcadores moleculares, el gen 16S rARN para bacterias y arqueas, la región ITS para hongos (Toju et al., 2012: Peiffer et al., 2013). La preparación de las librerías se realizó por medio de las metodologías previamente descritas (Caporaso et al., 2012; Caro-Quintero et al., 2015; Faith et al., 2013). La clasificación y análisis de las lecturas obtenidas se realizó, por medio del programa Qiime utilizando las correspondientes bases de datos, para las secuencias de 16S rARN se utiliza la base de datos desarrollada por el Ribosomal Data Project (Wang et al., 2007) mientras que para la asignación de las secuencias de ITS se utilizó la base de datos Unite (Abarenkov et al., 2010).
4. Componente Fitopatógenos En los sitios de colecta en las Zonas de Caguán-Caquetá y Putumayo se tomaron muestras de tejido de especies relacionadas con los géneros Herrania y Theobroma que presentaban síntomas y signos relacionados con los patógenos de interés. Las muestras colectadas se procesaron en el laboratorio de Microbiología Agrícola de Agrosavia, posterior al proceso de lavado y desinfección. Las muestras se sembraron en medios de cultivo selectivos y posteriormente se incubaron durante 30 días. De cada aislamiento obtenido se realizaron pases sucesivos en los diferentes medios de cultivo selectivo, e igualmente una vez purificado cada aislamiento se realizó una conservación de plugs de agar con micelio conservados en agua estéril. A partir de los plugs conservados de los 33 aislamientos, se realizó una siembra de cada uno de los posibles fitopatógenos en caldo PDB y caldo extracto de malta con el fin de obtener biomasa para la extracción de ADN. A partir del cultivo de aislamientos sembrados en caldo PDB que presentaron crecimiento, se procedió a filtrar la biomasa y posteriormente se liofilizó durante 24 horas. La biomasa liofilizada se maceró con nitrógeno líquido y el micelio pulverizado se empleó para la estandarización del protocolo de extracción de ADN. Para la extracción se emplearon el protocolo de extracción de ADN CTAB 2% y el protocolo comercial descrito por ZYMO Research para el Quick -DNA Kit fúngica / bacteriana Microprep. Posteriormente, se amplificó la región ITS utilizando cebadores ITS 1 y 4 y los amplificados se enviaron para su secuenciación. Cada secuencia se comparó las secuencias depositadas en el GeneBank para su identificación.

Este conjunto de datos comprende la información de 1.020 registros biológicos, pertenecientres a los reinos Plantae(735), Animalia(282) y Fungi(3). Para el reino Plantae los registros estan distribuidos en 4 clases, 21 ordenes, 40 familias y 92 géneros. Un 82% esta clasificado a nivel de especie, un 12% a género y el resto a familia y reino.

1. Magnoliopsida
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2. Eudicotyledoneae
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3. Monocotyledoneae
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4. Liliopsida
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El reino Animalia esta distribuido en 2 clases, 16 ordenes y 58 familias. Un 51% esta clasificado a nivel de familia, 25% a nivel de género, 20% a nivel de orden y el restane a subfamilia y clase.

1. Arachnida
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2. Insecta
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El reino Fungi esta distribuido en 2 clases, 2 ordenes, 2 familias y 2 géneros. Todos estan clasificados a nivel de especie.

1. Agaricomycetes
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2. Leotiomycetes
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Las zonas de recolección de especímenes fueron Caguán-Caquetá-Putumayo, consideradas parte del centro de origen de cacao silvestre.