Hongos formadores de micorrizas arbusculares de la transición Andino-Amazónica del departamento del Caquetá - Proyecto Colombia BIO

Study Extent

El estudio se realizó en el camino Andaqui, en el municipio de Belén de los Andaquies, departamento del Caquetá. Por la trocha del camino Andaqui se hizo un recorrido desde la divisoria de aguas límite de los departamentos del Huila y Caquetá, hasta la vereda de las verdes, hasta los puentes de la quebrada de las verdes y el río pescado. En total se realizaron 11 puntos cada 125 metros sobre el nivel del mar, desde 1875 hasta los 500 msnm como se observa en la figura 1 los cuales fueron numerados con respecto a su altura, donde la altura máxima de 1875 msnm era la 1, y la altura mínima de 500 msnm fue 11. Los puntos se realizaban en las zonas que estaban a la altura exacta y contaban con una cobertura natural, lo menos intervenida posible, por lo que en algunos puntos no fue posible realizar el punto y se realizaron en otros lugares por encontrarse pastos de ganadería.

Sampling

En cada uno de los cinco puntos de muestreo, se colectaron alrededor cinco (5) sub-muestras del suelo superficial (0-20cm), retirando la capa de hojarasca superficial si está presente. Las sub-muestras son colectadas en la misma bolsa plástica, y homogenizadas para obtener una muestra compuesta de aproximadamente 200 gramos de suelo. En total se colectaron 54 muestras de suelo para la determinación de bacterias en laboratorio por técnicas moleculares. Para la determinación taxonómica de microorganismos del suelo (Bacterias y Arqueas) en el laboratorio, se seguirá la metodología estandarizada en el laboratorio de biotecnología y recursos genéticos del Instituto Amazónico de Investigaciones Científicas –Sinchi. La extracción de ADN de agua, sedimentos y suelos se realizará usando los kits: powerwater DNA isolation Kit (MoBioLaboratories Carlsbad, CA), powersoil DNA isolation (MoBioLaboratories Carlsbad, CA) y núcleo spin soil –DNA, RNA and proteinpurification (macherey-nagel Alemania), respectivamente. Siguiendo las instrucciones del fabricante. Se amplificará la región V3-V4 del gen 16S ARNr con los iniciadores S-D-Bact-0341-b-S-17, 5-CCTACGGGNGGCWGCAG-3 y S-D-Bact-0785-a-A-21, 5-GACTACHVGGGTATCTATCC-3 descritos por Herlemann et al. (2011). Las muestras serán enviadas a Macrogen (Corea) para ser secuenciadas en una corrida de paired-endMiSeq2 X 300. El análisis de las secuencias se realizará con el programa QIIME scripts versión 1.8.0-20140103 (Caporaso et al. 2010). La asignación taxonómica se realizará con la base de datos de Greengenes. La abundancia relativa de los diferentes grupos microbianos se estimará en cada comunidad comparando el número de secuencias clasificadas que pertenecen a un grupo bacteriano específico versus el número de secuencias clasificadas por muestra."

Quality Control

En campo las bolsas van marcadas con el número de cada punto, con las siglas del nombre del municipio de muestreo Belén de los Andaquies (BA), un número continuo para las alturas de los puntos de muestreos donde la altura máxima de 1875 msnm, así: BA1875. En laboratorio se mantuvo el mismo código para identificar cada una de las muestras durante el aislamiento de las esporas de los hongos, la cual es la estructura morfológica para su determinación taxonómica. El mismo código fue usado para la muestra de suelo para determinar hongos formadores de micorrizas arbusculares por métodos moleculares. Ajuste de vocabularios controlados en el elemento de registro: basisOfRecord de acuerdo a la naturaleza de los datos.

Method steps

1. Dos técnicas de laboratorio fueron usadas para procesar las muestras de suelo para la determinación de hongos formadores de micorrizas arbusculares: a) Determinación taxonómica a partir de características morfológicas de las esporas; y b) Determinación taxonómica a partir de técnicas moleculares.
2. Para la determinación taxonómica a partir de características morfológicas de las esporas, se toman 10g de suelo de cada muestra (por triplicado), y se separan las esporas de hongos formadores de micorrizas arbusculares por medio de un tamizado húmedo seguido de una centrifugación en gradiente de sacarosa, siguiendo la metodología de Gerdemann y Nicolson (1964). Luego de aisladas las esporas, se realizaron montajes en lactoglicerol y y lactoglicerol con reactivo del Melzer de más o menos 10 esporas de cada morfotipo para evaluar sus características. Esta información fue recogida a través de dibujos y fotos. La determinación taxonómica de los morfotipos se realizó con base en vouchers de referencia decritos en la página web del International Collection of (vesicular-) Arbuscular Mycorrhizal Fungi INVAM (http://invam.wvu.edu); en el catálogo de Peña-Venegas et al. (2006); y en el catálogo de Schenck y Perez (1988) que incluye morfotipos que fueron descritos para Colombia pero que nunca han sido reportados en otros documentos académicos. Como los inventarios fueron hechos a partir de las esporas colectadas en campo, no todas las esporas estaban frescas y no siempre permiten su adecuada determinación taxonómica.
3. Es importante indicar aun cuando la determinación de hongos micorriza arbuscular a partir de los morfotipos de esporas encontrados es de alguna manera sencilla de realizar, no todos los hongos formadores de micorrizas arbusculares esporulan, y algunos que esporulan, sólo lo hacen bajo ciertas condiciones (Sanders 2004; Landis et al. 2004). Así, por la técnica de determinación taxonómica a partir de características morfológicas de las esporas, solo logramos una aproximación a la diversidad total de este grupo de organismos en los suelos estudiados. Por ello, se hace necesario complementarla con otras metodologías como la determinación taxonómica a partir de técnicas moleculares.
4. Para la determinación taxonómica de hongos formadores de micorrizas arbusculares a partir de técnicas moleculares se extrajo el ADN de los hongos de 5 g de suelo seco usando el kit Se realizó la extracción de ADN usando el kit NucleoSpin® Soil de Macherey-Nagel de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Las secuencias de hongos formadores de micorrizas arbusculares son amplificadas del ADN extraído usando los primers NS31 y AML2 (Simon et al., 1992; Lee et al., 2008) unidos a unos primers de secuencia A and B, tal como fue descrito por Öpik et al.(2013). Para identificar las secuencias, se usaron códigos de barras (Parameswaran et al., 2007) que se insertaron entre A y NS31, y primer B y AML2. Luego se procede a hacer una PCR en dos pasos ( Öpik et al. 2013). Luego, los productos de la PCR fueron separados por medio de una electrophoresis en agar 1.5% en 0.5TBE. Los productos de la amplificación fueron purificados por elución de banda y cuantificado por Qubit ®. Del ADN obtenido, se tomaron 1.7 μg los cuales fueron secuenciados para obtener las secuencias de la comunidad de hongos micorriza arbuscular en los suelos evaluados.
5. Las secuencias que tenían el correcto código de barras, los primers usados, y un tamaño mayor a 170 pares de bases fueron analizados bioinformáticamente. Secuencias muy largas (más de 520 pares de bases) fueron cortadas a este largo e incluidas en el análisis. A esas secuencias se le quitaron las quimeras usando el programa UCHIME v7.0.1090 (Edgar et al., 2011). A las secuencias limpias se les retiraron los códigos de barra y los primers, y se identificaron cotejándolas con la base de datos de hongos micorriza arbuscular MaarjAM con el programa BLAST v2.5.0 (Camacho et al., 2009) usando una técnica de selección abierta inespecífica de unidades taxonómicas (Bik et al., 2012). Se consideraron secuencias iguales cuando el porcentaje de similaridad entre la secuencia obtenida y la registrada en la base de datos MaarjAM fue ≥ 97%; y un alineamiento no menor a 95%. Las secuencias que no fueron similares a ningún taxon virtual de los reportados en la base de datos MaarjAM, fueron cotejadas con las secuencias publicadas en la base INSDC (International Nucleotide Sequence Database Collaboration), usando como criterio de aceptación 90%.

Muestras identificadas hasta género y clasificadas en 8 géneros diferentes: Glomus, Gigaspora, Acaulospora, Archaeospora, Scutellospora, Claroideoglomus, Diversispora, Paraglomus. Glomus es le género más frecuente y abundante.

1. Glomeraceae
   rank: family
2. Gigasporaceae
   rank: family
3. Acaulosporaceae
   rank: family
4. Archaeosporaceae
   rank: family
5. Paraglomeraceae
   rank: family
6. Diversisporaceae
   rank: family
7. Clareidoglomaceae
   rank: family

La transición Andino-Amazónica, iniciando en el departamento de Huila, municipio de Acevedo y descendiendo a lo largo del camino Andaki hasta el municipio de Belén de los Andaquíes en el departamento de Caquetá. Abarca desde el bosque de niebla hasta el piedemonte amazónico.