Biodiversidad identificada por medio de metabarcoding asociada al Estudio de Impacto ambiental para el proyecto Piloto de Investigación Integral - Kalé

Study Extent

Los monitoreos se ubicaron en el área de incidencia del proyecto EIA Kalé en Puerto Wilches, municipio del departamento de Santander, que forma parte de la provincia de Yariguies. El área hidrográfica de la zona incidencia del Proyecto PPII Kále está enmarcado a nivel regional dentro de la dinámica fluvial del río Magdalena-Cauca, localizada en la margen derecha de la zona hidrográfica del Magdalena Medio; subzona hidrográfica del río Lebrija. El monitoreo de microorganismos se realizó en las zonas de pozos no convencionales con evidencia documentada de afectación por fractura hidráulica considerando el ecosistema hídricos, sedimento y agua superficial.

Sampling

Para capturar la variabilidad del sistema biológico en cada sitio, se tomó un número de réplicas representativo de la heterogeneidad del área. La selección del número y ubicación de las réplicas biológicas se hizo luego de estructurar un diseño experimental entre los diferentes grupos biológicos, y fue refinado en una pre-salida de calibración. Para capturar la variabilidad, se tomaron al menos 3 muestras en cada punto de monitoreo biológico de agua y sedimento. La metodología se basa en el Protocolo para la toma de muestras ambientales de agua, sedimento, suelo y extracción de ADN para metabarcoding, propuesto por la Agencia Nacional de Hidrocarburos – ANH y el Instituto de Investigación de Recursos Biológicos Alexander von Humboldt – IavH.

Method steps

1. La metodología para el muestreo de microorganismos se dividio en muestras de agua, sedimento y suelo.
2. Muestras de agua: - Se propuso una unidad de muestreo compuesta de tres muestras simples, tomadas a lo largo de un transecto en el cuerpo de agua. Si se selecciona un transecto de al menos 150 metros de longitud, cada muestra de agua se tomó cada 50 metros. - En el caso de sistemas lóticos, las muestras se tomaron desde en dirección contraria al flujo del agua, para evitar perturbar el agua y modificar las condiciones de la muestra. Para la toma de cada muestra, se tomó al menos 1 litro de agua superficial usando recipientes previamente esterilizados y usando guantes y tapaboca limpios. Se almacenó inmediatamente a baja temperatura, al menos 4ºC, usando una nevera con hielo, un refrigerador o un tanque de nitrógeno líquido. Entre la toma de cada muestra se cambió los guantes y tapabocas. - En el caso de sistemas lénticos, se tomaron tres muestras tratando de cubrir el área del cuerpo de agua, siendo una de las muestras tomada hacia el centro del cuerpo de agua. Si esto no fue posible, se tomaron las tres muestras en tres puntos equidistantes en las orillas. -Una vez se tomaron las muestras de agua de la unidad de muestreo se procesó las muestras o estación de trabajo. El procesamiento se llevó a cabo dentro de las 12 horas siguientes a la toma de muestra, siempre y cuando se asegurará la preservación de la muestra con alguno de los métodos mencionados anteriormente. - Para metabarcoding se filtró las muestras de agua usando filtros de nitrato de celulosa con un tamaño de poro de al menos 0.45 µm. Una vez terminado el proceso de filtración se preservó el tubo de 50 ml con etanol absoluto. - La extracción de ADN se realizó en campo usando el kit comercial NucleoSpinTM Soil de Macherey-NagelTM con modificaciones en el protocolo para extraer ADN extracelular, siguiendo a Taberlet et al. 2018
3. Muestras de sedimento: - Al igual que para aguas, se propuso una unidad de muestreo compuesta de tres muestras simples, tomadas a lo largo de un transecto en el cuerpo de agua, cuya longitud dependió enteramente de la escala y el objetivo del estudio. Las muestras de sedimento en preferencia se tomaron en el mismo lugar de toma de muestras de aguas superficiales. - Las muestras de sedimento se tomaron usando diferentes utensilios como palas, dragas o cilindros. En el lugar seleccionado se tomó el sedimento superficial de al menos 10 cm de profundidad con cualquiera de los equipos mencionados, estando estos limpios y esterilizados en el caso de las palas o los cilindros. - No se incluyó en la muestra material orgánico como plantas, algas o raíces; estos fueron retirados. Se almacenaron las muestras recolectadas en una bolsa hermética o frasco, previamente esterilizado, e inmediatamente se preservó a bajas temperaturas usando una nevera con hielo, refrigerador o nitrógeno líquido para dirigirlo al lugar de procesamiento de las muestras o estación de trabajo. El procesamiento se llevó a cabo dentro de las 12 horas siguientes a la toma de muestra, siempre y cuando se asegurará la preservación del ADN. -Una vez en la estación de trabajo, se homogenizó, mezclando bien cada una de las muestras. De cada muestra, se tomaron 15 g de sedimento para el protocolo de extracción de ADN extracelular y se depositaron en un tubo de 50 ml usando una espátula o cuchara previamente esterilizada. Para la extracción de ADN intracelular se tomaron 250-500 mg y se depositaron en un tubo esterilizado de 2 ml. Cada muestra tomada en el punto o unidad de muestreo tuvo su correspondiente tubo de 50 ml o de 2 ml, a cada uno de los cuales se les realizó la extracción de ADN. Se conservaron los tubos de 50 ml o 2 ml con los 15 g o 250-500 mg correspondientes de sedimento a -20ºC hasta el momento de la extracción de ADN. -La extracción de ADN se realizó en campo usando el kit comercial NucleoSpinTM Soil de Macherey-NagelTM con modificaciones en el protocolo para extraer ADN extracelular, siguiendo a Taberlet et al. 2018.
4. Muestras de suelo: - Se realizó una unidad de muestreo con tres muestras compuestas, tomadas cada una entre cuadrantes dentro del área estipulada como unidad muestreal. El área de cada cuadrante dependió enteramente de la escala y el objetivo del estudio. -Si dado el área de su estudio selecciona una unidad de muestreo de 1 ha, se realizó cuadrantes de alrededor de 30m x 30m, los cuales no se sobrepusieron entre ellos. En cada cuadrante, se generó una cuadrícula de tres puntos equidistantes, a lo largo y ancho, iniciando y terminando en los vértices del cuadrante. En este caso, se tomaron 9 puntos separados cada 15 metros. Usando guantes, tapabocas y una pala o barreno previamente esterilizado, se obtuvo una sub-muestra de suelo de cada uno de los puntos y se depositó en una bolsa plástica hermética. - Las submuestras de cada cuadrante fueron depositadas en la misma bolsa, que posteriormente fue almacenada en una nevera con hielo, refrigerador o nitrógeno líquido, para preservarla adecuadamente hasta su procesamiento. Una vez finalizó la toma de las submuestras de cada cuadrante se dirigieron a la estación de trabajo. - En la estación de trabajo, se homogenizó mezclando bien cada una de las tres muestras. Para el protocolo de ADN extracelular de cada muestra, se obtuvo 15 g de suelo y se depositaron en un tubo de 50 ml usando una espátula o cuchara previamente esterilizada. Para el protocolo de ADN intracelular de cada muestra, se obtuvó 250-500 mg de suelo y se depositó en un tubo de 2 ml usando una espátula o cuchara previamente esterilizada. -Cada muestra tomada en el punto o unidad de muestreo tuvo su correspondiente tubo de 50 ml o 2 ml, dependiendo del protocolo, los cuales fueron usados para la extracción de ADN. Se conservaron los tubos de 50 ml con los 15 g de suelo o los tubos de 2 ml con 250-500 mg de suelo a -20ºC o en seco con sílica gel, hasta el momento de la extracción de ADN. Con las muestras tomadas y procesadas se procedió a la extracción de ADN. -La extracción de ADN se realizó en campo usando el kit comercial NucleoSpinTM Soil de Macherey-NagelTM con modificaciones en el protocolo para extraer ADN extracelular, siguiendo a Taberlet et al. 2018.
5. Una vez colectadas las muestras se procedió al procesamiento y análisis de las mismas en tres etapas específicas: Laboratorio molecular y secuenciación: De las muestras obtenidas en campo, se extrajo el ADN usando kits y protocolos estándares. Estas muestras extraídas de ADN se enviaron para secuenciación de última generación (Illumina). La diversidad global de bacterias, hongos y otros eucariotas se examinaron a través de la técnica molecular de metabarcoding, usando los marcadores moleculares 16S en bacterias (región V3-V4), ITS en hongos y 18S en eucaria. Trabajo bioinformático de secuencias genéticas: Las secuencias generadas por tecnología de última generación (Illumina) fueron ensambladas y separadas por sitio de muestreo usando diferentes programas bioinformáticos. Las secuencias finales de metabarcoding se analizaron usando la plataforma QUIIME 2 para cada grupo biológico independientemente. Interpretación y aplicaciones ecológicas de datos de diversidad obtenidos por metabarcoding: Para cada grupo biológico se estimó la composición, recambio y diversidad de comunidades biológicas con base en material genético extraído de agua, sedimentos y suelo, y analizado según la técnica de metabarcoding. Se estimó la biodiversidad con base en los índices ecológicos como Shannon y Simpson. Esto, entre otras, permitió la identificación de linajes o grupos microbiológicos que pueden ser utilizados como bioindicadores de respuestas biológicas y funcionales a actividades industriales. Para la publicación de datos a través del SiB Colombia, se organizaron los OTUs obtenidos para todos los grupos y se conservaron los que tuvieron al menos una lectura de ADN en alguna de las 120 estaciones de muestreo. La taxonomía tal cual se obtuvo al compararla con la base de referencia de NCBI se documentó en el elemento higherClassification y se realizó una limpieza de la misma para documentar el scientificName. Para cada evento de muestreo se documentó la información asociada la metodología en la extensión DNA derived data.

Este recurso contiene un total de 41.850 registros biológicos, pertenecientes a los reinos Bacteria (34.377), Chromista (1.734), Fungi (1.561), Animalia (1.380), Plantae (1.279), Protozoa (1.213) y Archaea (306). Con un 29% clasificado a nivel de género, 24% a familia, 18% a orden, 13% a clase, 7% a filo, 2% a especie y 7% a otras categorías.

1. Bacteria
   rank: kingdom
2. Chromista
   rank: kingdom
3. Fungi
   rank: kingdom
4. Animalia
   rank: kingdom
5. Plantae
   rank: kingdom
6. Protozoa
   rank: kingdom
7. Archaea
   rank: kingdom

Los monitoreos se ubicaron en el área de incidencia del proyecto EIA Kalé en Puerto Wilches, municipio del departamento de Santander, que forma parte de la provincia de Yariguies. El área hidrográfica de la zona de incidencia del Proyecto PPII Kále está enmarcado a nivel regional dentro de la dinámica fluvial del río Magdalena-Cauca, localizada en la margen derecha de la zona hidrográfica del Magdalena Medio; subzona hidrográfica del río Lebrija. A nivel local, en cuencas de orden 4, se identificaron la quebrada la Trece que entrega sus aguas a la ciénaga de Yariguí, y la cuenca del caño Negro que sirve de efluente de la ciénaga de Yariguí. El monitoreo de microorganismos se realizó en las zonas de pozos no convencionales con evidencia documentada de afectación por fractura hidráulica considerando el ecosistema hídrico.