Colección de Microorganismos de interés en Salud Animal Bacterias-Virus - AGROSAVIA

Study Extent

Los aislamientos fueron colectados de diferentes departamentos que componen el territorio nacional. La colección también contiene cepas de referencia que fueron donados por el instituto Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA)- Laboratorio de Referencia para Leptospirosis en Argentina; por el INPPAZ (Instituto Panamericano de Protección de Alimentos y Zoonosis).

Sampling

Se realizó colecta de material biológico como leche bovina, materia fecal, orina, tejidos de origen animal, así como también muestras ambientales para el aislamiento de los microorganismos. Las colectas fueron realizadas en fincas de sistemas de producción bovina, avícola y en plantas de beneficio. Todas las colectadas fueron realizadas en diferentes departamentos del territorio nacional. Los métodos de preservación empelados fueron congelación a -80°C y el almacenamiento a ultra baja temperatura en nitrógeno líquido a 196°C para la conservación a largo plazo, utilizando crioprotectores como el dimetil sulfoxido (DMSO) y glicerol a diferentes concentraciones. La liofilización fue otro método utilizado para conservación en el cual se emplean mezclas de crioprotectantes: leche descremada 10 % + glutamato sódico al 1 % (LG) y /o Sacarosa 10 % + Gelatina 1 %, tanto para microorganismos Gram positivos y Gram negativos.

Quality Control

En Leptospira la identificación taxonómica hasta especie se realizó mediante amplificación de dos blancos moleculares: una región de 330pb del gen rrs y una región de 600pb del gen rpoB. La concatenación de las secuencias de estos dos genes permitió la clasificación del microorganismo en los grupos de patogenicidad reportados hasta el momento, y su identificación a nivel de género y especie. Otras técnicas moleculares como Ribotipificación tipo Southern blot y Análisis de repeticiones en tándem en número variable en múltiples locus (MLVA), fueron utilizadas para subtipificación hasta serovar. En B. abortus, la identificación se hizo mediante técnicas de microbiología convencional como requerimientos de CO2, producción de ácido sulfhídrico (H2S) sobre tiras de acetato de plomo, producción de la enzima ureasa en forma semicuantitativa (1-2 horas de incubación), prueba de la citocromo-oxidasa, aglutinación en lámina con el suero policlonal anti-Brucella abortus, crecimiento en presencia del azúcar eritritol en concentraciones de 1 y 2 mg/mL, crecimiento en presencia de colorantes como: Tionina (diluciones 1:5.000 y 1:10.000), fucsina básica (diluciones 1:25.000 y 1:50.000) y Safranina (diluciones1:5.000 y 1:10.000). La morfología celular se determinó mediante coloración de Gram y la tinción modificada de Ziehl–Neelsen ó Stamp. También ser realizó PCR múltiple para la amplificación de dos blancos moleculares: una región de 1270pb del gen ery encargada del catabolismo del eritritol en el género Brucella y una región de 498pb del gen que codifica para la secuencia de inserción IS711 característico de la especie B. abortus. La subtipificación de este microorganismo se hizo mediante Ribotipificación tipo Southern blot y Análisis de repeticiones en tándem en número variable en múltiples locus (MLVA), las cuales generaron patrones genéticos característicos por comparación con los patrones obtenidos a partir de cepas de referencia. Para el aislamiento del virus de la enfermedad de la estomatitis vesicular, se tomaron muestras de tejido lingual de bovino. Para la identificación taxonómica del virus se hicieron pruebas serológicas como seroneutralización para la identificación del serotipo, esta identificación serológica fue complementada mediante técnicas moleculares como PCR, para la amplificación de una región del gen que codifica para la proteína P (fosfoproteína), la cual se unen con la nucleocápside y forman el complejo de transcripción y replicación viral, junto con la proteína y L (ARN polimerasa dependiente de ARN). El aislamiento del virus de Newcastle se realizó en diferentes departamentos del país incluyendo Antioquia, Atlántico, Bolívar, Cesar, Córdoba, Cundinamarca, Magdalena, Santander, Tolima y Valle. Asimismo, las cepas circulantes fueron identificadas en diversos hospederos como aves, mamíferos e insectos y la caracterización del tipo de virulencia se hizo con base en índices de patogenicidad fisiológicos como el índice de mortalidad embrionaria (MDT), el índice de mortalidad intracerebral (ICPI) y el índice de mortalidad intravenosa (IVPI). Así mismo se hizo una caracterización molecular mediante la amplificación del gen que codifica para el sitio de clivaje de la proteína de fusión (F). Las muestras de leche bovina después de su colecta son mantenidas en refrigeración hasta su procesamiento en el laboratorio. Para el aislamiento de Staphylococcus y Streptococcus las muestras de leche son sembradas en agar sangre e incubadas a 37°C por 24 horas. A partir del cultivo positivo, fueron repicadas en agar BHI, a partir de este se realizó coloración de Gram y prueba de catalasa. Los cultivos catalasa positivos se realizaron pruebas bioquímicas convencionales: producción de enzimas (lecitinasas, lipasas, en Baird Parker, coagulasa, DNAsas), fermentación de azucares como el manitol en altas concentraciones de NaCl (7.5%), reducción del telurito de potasio. Tanto para los cultivos catalasa positivo y negativos se evaluó perfiles de susceptibilidad antimicrobiana por el método de difusión en disco o Kirby Bauer (CLSI 2013) e identificación hasta especie por métodos fenotípicos automatizados empleando tarjetas VITEK® para Gram positivos. La identificación molecular en cepas de Staphylococcus por amplificación una región de 791pb del gen 16S rRNA. Para la clasificación específica de S. aureus se realiza detección del gen nuc y del gen coa, factores de virulencia de importancia en la patogenicidad de S. aureus. Para la identificación de Streptococcus se amplificación de genes skA y pauA, específico de S. agalactiae y S. uberis respectivamente. Para el aislamiento de Lactobacillus las muestras de leche son sembradas en agar MRS (De Man, Rogosa, Sharpe) en atmosfera anaeróbica a 37°C. A partir de cultivos se efectúa la prueba de la catalasa (reacción negativa) y se evidencia su morfología microscópica a bacilos Gram positivos. También puede realizar identificación bioquímica mediante el uso de kit comerciles API 5OCHL. Por métodos moleculares estas cepas se han evaluado mediante la amplificación de una región del gen 16S ADNr. Para el aislamiento de E. coli O157:H7, aproximadamente 10g de materia fecal bovina son sembrados en 90mL de Caldo EC e incubados por 6 horas a 37°C, a partir de este cultivo se tomó 1mL y se realizó separación inmunomagnética, después del tratamiento con las perlas, las muestras fueron sembradas en Agar Mac Conkey-Sorbitol (MK-S) para determinar la no fermentación del sorbitol y poder diferenciarlo de otras E. coli. Colonias con morfología presuntiva se les realiza extracción de ADN por ebullición y PCR múltiple para la amplificación de los genes sxt1 y sxt2 que codifican para la toxina tipo siga. También se pueden utilizar otros medios para la diferenciación entre enterobacterias, como agar TSI, urea, citrato, LIA y SIM. Para aislamientos de Salmonella se evalúa la morfología celular por coloración de Gram. A partir de cultivos puros se hacen repiques en medios selectivos como agar entérico Hektoen (HE) y Xilosa-Lisina Desoxicolato (XLD) para evidenciar la fermentación de azucares como la glucosa. Se observan colonias verdeazuladas con o sin centro negro y colonias rojas con centros de color negro, respectivamente. También se pueden utilizar otros medios para la diferenciación entre enterobacterias, como agar TSI, urea, citrato, LIA y SIM. La identificación completa incluye una evaluación serológica por serotipificación para clasificación de serovariedades según la gran diversidad de antígenos somáticos (O), lipopolisacárido (LPS) y antígenos flagelares (H), de acuerdo con la clasificación del esquema de White-Kauffmann–Le Minor.

Method steps

1. Para el aislamiento de Leptospira a partir de orina bovina se siguió el siguiente procedimiento 1 Se Tomó la muestra de orina y rápidamente se filtró por membrana de 0.22m a medio EMJH semisólido con 5 fluoruracilo, y se llevó a incubar a 30°C. 2. Se revisaron los cultivos cada 8 días para observar crecimiento y verificar que no exista contaminación. Sí existe contaminación el cultivo debe ser filtrado con membrana de 0.22m y llevado nuevamente a incubación a 30°C. 3. Al observar crecimiento de Leptospira, se debe sembrar en un nuevo tubo de EMJH, hasta obtener un crecimiento abundante del microorganismo. Mantener la revisión de los tubos durante 3 meses, después de este tiempo sí no existe crecimiento se puede descartar los tubos. 4. Conservar el nuevo aislamiento a temperatura ambiente en medio semisólido de EMJH y en nitrógeno líquido -196ºC usando DMSO al 2.5% como crioprotector.
2. Aislamiento de Leptospira a partir de riñón bovino: 1 El riñón entero debe ser transportado sin refrigeración y debe ser procesado el mismo día de la toma de muestra. 2 Retirar el tejido graso con tijeras estériles y esterilizar el área en donde se va a tomar la muestra con una espátula calentada al rojo vivo. 3 Perforar el riñón con pipeta pasteur estéril hasta encontrar la médula y el hilio renal, sitios en donde permanece la leptospiras. 4. Aspirar el material líquido renal encontrado, utilizando la pipeta pasteur, ayudado por una chupita y depositarlo en medio EMJH líquido, realizar el procedimiento con mechero de alcohol para garantizar esterilidad. Transportar al laboratorio para su procesamiento. 5. Tomar 3ml del cultivo inicial y pasarlo por filtros de 0.22m, el producto de la filtración sembrarlo en medio EMJH semisólido e incubar a 30°C. 7 Revisar los cultivos cada 8 días para observar crecimiento y verificar que no exista contaminación. Sí existe contaminación el cultivo debe ser filtrado con membrana de 0.22m y llevado nuevamente a incubación a 30°C. 8 Si observa crecimiento de Leptospira sembrar en un nuevo tubo de EMJH, hasta obtener un crecimiento abundante del microorganismo. Mantener la revisión de los tubos durante 3 meses, después de este tiempo sí no existe crecimiento se puede descartar los tubos. 9 Conservar el nuevo aislamiento a temperatura ambiente en medio semisólido de EMJH y en nitrogeno líquido -196ºC usando DMSO al 2.5% como crioportector.
3. Para el aislamiento de B. abortus se tomaron muestras del cuarto estómago, hígado, pulmón fetal y placenta. Estas muestras se cultivaron en medios selectivos, enriquecidos y diferenciales como agar brucella enriquecido con suero equino, agar sangre con antibióticos.
4. Para el aislamiento de E. coli O157:H7 se toma muestra de materia fecal, aproximadamente 10g son sembrados en 90mL de Caldo EC e incubados por 6 horas a 37°C, a partir de este cultivo se tomó 1mL y se realizó separación inmunomagnética, después del tratamiento con las perlas, las muestras fueron sembradas en medios selectivos y diferenciales.

La colección de bacterias cuentas con 13 familias y 17 géneros. Los más representativos son: Salmonella, Streptococcus, Staphylococcus, E. coli, Leptospira, Brucella abortus y Lactobacillus.

1. Staphylococcus
   rank: genus
2. Salmonella
   rank: genus
3. Streptococcus
   rank: genus
4. Escherichia coli
   rank: species
5. Brucella abortus
   rank: biovar
6. Leptospira
   rank: species
7. Lactobacillus
   rank: genus

La colección de interés en salud animal de AGROSAVIA cuenta con el virus de la enfermedad de Newcastle y con el virus de la enfermedad de estomatitis vesicular.

1. Avian orthoavulavirus 1
   common name: Virus de la enfermedad de Newcastle rank: species
2. Virus Estomatitis vesicular
   rank: species

Los registros provienen de Colombia (669) y Argentina (33).