Colección de Microorganismos de Interés en Salud Animal de Ectoparásitos-Hemoparásitos-AGROSAVIA

Study Extent

Los aislamientos originarios de Colombia, fueron obtenidos por AGROSAVIA a partir de muestras colectadas de animales de producción en fincas de diferentes regiones geográficas, y otra parte de los aislamientos fue donada por el Instituto Colombiano Agropecuario -ICA. Instituto de parasitologia de Hannover, Universidad Federal de ViÇosa.

Sampling

Las accesiones de la colección de hemoparásitos fueron aisladas tanto de sangre infectada como de garrapatas ingurgitadas (teleoginas) como es el caso de las accesiones del genero Babesia. Los muestreos se realizaron en predios de sistemas de producción bovina con reportes de casos clínicos confirmados de enfermedad hemoparasitaria o reportes de animales con fiebre, letargo, emaciación, debilidad, deshidratación, anemia, ictericia, disminución de parámetros reproductivos, abortos. El método de conservación empelado es almacenamiento en nitrógeno líquido a -196°C utilizando glicerol:glucosa como crioprotector.

Quality Control

Con el fin de confirmar la identidad del material colectado y garantizar que no se encuentre mezclado con otros hemoparásitos, se realiza un control de calidad por medio de la amplificación, por PCR, de un conjunto de marcadores específicos para cada uno de los géneros. Anaplasma marginale: marcador msp4 de 850pb con los siguientes inicia- dores: forward: CAGAGAATTGTTTACAGGGGGCTT; reverse: GCTGAACAG- GAATCTTGCTCCAAG (Vidotto et al., 2006). Babesia bovis: marcador Check de 612pb con los siguientes iniciadores: forward: CCGAACTACCATCCGAAGAA; reverse: TCTCCGATGATTGGTTC- CAC (Guillemi et al., 2013). Babesia bigemina: marcador Sbp3 de 625pb con los siguientes iniciadores: forward: AGGGGTGTGGTCAAGTTGGT; reverse: CTTCATCATCAGGGTCC- GCG (Guillemi et al., 2013). Trypanosoma vivax: marcador ctl de 177pb con los siguientes iniciadores: forward: TTAAAGCTTCCACGAGTTCTTGATGATCCAGTA; reverse: GCCAT- CGCCAAGTACCTCGCCGA (Cortez et al., 2009).

Method steps

1. Las accesiones de la colección de hemoparásitos fueron aisladas tanto de sangre infectada como de garrapatas ingurgitadas (teleoginas) como es el caso de las accesiones del genero Babesia. Los muestreos se realizaron en predios de sistemas de producción bovina con reportes de casos clínicos confirmados de enfermedad hemoparasitaria o reportes de animales con fiebre, letargo, emaciación, debilidad, deshidratación, anemia, ictericia, disminución de parámetros reproductivos, abortos.
2. Para el aislamiento de Anaplasma, Babesia o Trypanosoma a partir de sangre infectada, se toman muestra de sangre en tubo vacutainer con EDTA a los casos clínicos confirmados, casos sospechosos y al grupo de animales con los cuales comparten el ciclo de producción. De cada muestra se realiza extendido sanguíneo sobre lámina porta objeto, se deja secar y se fija con metanol durante 10 minutos, para luego colorear el extendido con colorante Giemsa. Confirmada la parasitemia por observación directa en los extendidos sanguíneos, se realiza un pool de sangre infectada de los animales positivos y la muestra es llevada al laboratorio donde se procede a leucoreducir la muestra mediante lavado de los góbulos rojos con solución PBS y centrifugación a 3000rpm, el sobrenadante con la capa de glóbulos blancos es removido y descartado. El lavado de la muestra se lleva a cabo 3 veces hasta obtener góbulos rojos concentrados. Posteriormente se ajusta el hematocrito de los globulos rojos lavados a un 30% y se mezcla la suspensión final con el crioprotectante en una proporción 1:1 en crioviales de 1,8ml. Los crioviales son almacenados directamente en nitrógeno líquido. Para el aislamiento de Trypanosoma y tras realizar la confirmación de la parasitemia por microscopia de los extendidos de sangre y mediante la técnica de Woo de microhematocrito, la muestra de sangre no es leucoreducida ya que se trata de un microorganismo extracelular y por esto la muestra es mezclada directamente con el crioprotectante en los crioviales, estos finalmente se almacenan en nitrógeno líquido.
3. El aislamiento de Babesia de garrapatas ingurgitadas requiere colectar hembras ingurgitadas de los animales infestados de distintos grupos que componen el hato, preferiblemente garrapatas que se hayan desprendido de manera natural o también desprendiéndolas manualmente con cuidado. Las garrapatas deben ser llevadas al laboratorio tan pronto sean colectadas, asegurando una humedad relativa del ambiente entre el 80%-90%, una temperatura que no supere los 30°C y un ambiente con baja luminosidad. Una vez en el laboratorio, las garrapatas se llevan a incubación a 26°C por 7 días, transcurrido este periodo se realiza frotis de hemolinfa durante cinco días. Los frotis son fijados con metanol y colorados con Giemsa. Confirmada la presencia de esporoquinetos de Babesia, se continua la incubación de las garrapatas para permitir la postura de huevos durante 14 días, tras lo cual, los huevos son transferidos a viales de vidrio en cantidades de 1g y sellados con tapones de gasa. Los viales se llevan a incubación a 26°C por 14 días hasta registrarse la eclosión de las larvas. Con las larvas obtenidas se realiza la infestación experimental de un ternero Bos taurus esplenectomizado y se realiza seguimiento clínico hematológico diario hasta observar los primeros síntomas de enfermedad hemoparasitaria. Se toma una muestra de sangre y se realiza extendido sanguíneo , fijación con metanol y coloración con Giemsa para confirmación por microscopia de la parasitemia. Confirmada la parasitemia por observación directa en los extendidos sanguíneos, se toma una muestra de sangre en bolsa de transfusión, esta es llevada al laboratorio donde se procede a leucoreducir la muestra mediante lavado de los góbulos rojos con solución PBS y centrifugación a 3000rpm, el sobrenadante con la capa de glóbulos blancos es removido y descartado. El lavado de la muestra se lleva a cabo 3 veces hasta obtener góbulos rojos concentrados. Posteriormente se ajusta el hematocrito de los globulos rojos lavados a un 30% y se mezcla la suspensión final con el crioprotectante en una proporción 1:1 en crioviales de 1,8ml. Los crioviales son almacenados directamente en nitrógeno líquido.

La colección de hemoparásitos esta conformada por tres géneros: Anaplasma, Babesia y Trypanosoma.

1. Anaplasma marginale
   rank: species
2. Babesia bigemina
   rank: species
3. Babesia bovis
   rank: species
4. Trypanosoma vivax
   rank: species
5. Trypanosoma theileri
   rank: species
6. Trypanosoma evansi
   rank: species

La colección de ectoparásitos está conformada por tres colonias de garrapatas del género Rhipicephalus, como también cuenta con dos líneas celulares obtenidas a partir de embriones de garrapatas del género Ixodes.

1. Rhipicephalus microplus
   rank: species
2. Ixodes scapularis
   rank: species

Los registros provienen de cuatro países, Colombia (148), Reino Unido (2), Australia (1) y Brasil (1).