Biodiversidad de grupos funcionales de microorganismos en el Parque Nacional Natural de Los Nevados, Colombia

Study Extent

n/a

Sampling

Se tomaron muestras de suelos rizosféricos en las Fincas Buenos Aires (3,769 m.s.n.m.), El Edén (3,590 m.s.n.m.) y La Secreta (3,432 m.s.n.m.) en la vereda El Bosque, municipio de Pereira, Risaralda. En cada sitio se evaluaron los usos del suelo: páramo, cultivo de papa (Solanum tuberosum) y ganadería en épocas seca y húmeda. En cada uno de los tipos de uso de suelo se evaluaron tres ventanas de observación, compuestas por 10 submuestras cada una. En total se evaluaron tres usos del suelo por tres fincas por dos épocas por tres ventanas de observación, para un total de 54 muestras. En cada muestra se determinó la abundancia y diversidad de microorganismos fijadores de nitrógeno, solubilizadores de fosfato y celulolíticos.

Quality Control

La validación y depuración de la información geográfica, taxonómica y los datos adicionales asociados con las muestras de suelo y los morfotipos aislados fueron incorporados en varios pasos del proyecto como un componente esencial del proceso de digitalización. La identificación de los morfotipos se realizó mediante Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al. 1990, Benson et al. 2000) y Genius PRO 5.1.5. y la confirmación de los nombre científicos de los especímenes se realizó utilizando las bases de datos: NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/), Ribosomal Database Project (http://rdp.cme.msu.edu/) y Catalog of Life (http://www.catalogueoflife.org/). Los departamentos Colombianos fueron codificados teniendo en cuenta la división político administrativa de Colombia suministrada por el Departamento Administrativo Nacional de Estadística - DANE (http://190.25.231.237/dvpbuscar/dvpbuscar.html).

Method steps

1. Se realizó el recuento de las unidades formadoras de colonia (UFC) de los microorganismos asociados a los grupos funcionales. Para los microorganismos fijadores de nitrógeno se realizó conteo y aislamiento utilizando el medio selectivo carente de nitrógeno según (Rennie 1981) con modificaciones: 5.0 g manitol; 5.0 g ácido málico; 0.5 mL lactato de sodio (60%, v/v); 0.8 g K2HPO4; 0.2 g KH2PO4; 0.2 g MgSO4.7H2O; 0,06 g CaCl2; 0,1 g NaCl; 0.001g extracto de levadura; 0.0025g Na2MoO4. 2H2O; 0.0024 g Na2EDTA; 0.0018 g FeSO4; 5 ug biotina; 10 ug ácido p-aminobenzoico; 18.0 g, agar; 2.0 ml azul de bromotimol (0.5% en etanol 95%), 1 L de agua destilada, pH 7. Para el conteo y aislamiento de microorganismos solubilizadores de fosfatos se utilizó el medio según Sundara y Sinha (1963) modificado: 0.5 g (NH4)2SO4; 0.2 g KCl; 0.3 g MgSO4.7H2O; 0.004 g MnSO4; 0.002 g FeSO4.7H2O; 0.2 g NaCl; 10 g glucosa; 0.5 g extracto de levadura, 0.1 g purpura de bromocresol; 5.0 g Ca3(PO4)2; 15 g agar; 1 L de agua destilada, pH 7.2. El conteo y aislamiento de los microorganismos celulolíticos se realizó utilizando el medio con carboximetilcelulosa al 1% como única fuente de carbono así: 0.5 g KH2PO4; 0.2 g MgSO4.7H2O; 0.1 g NH4NO3; 0.02 g FeSO4.7H2O; 0.05 g Ca(NO3)2.4H2O; 15 g agar, 10 g CMC, 1 L de agua destilada. Se utilizó pH 7.0 para bacterias y pH 5.0 para hongos con adición de 34 g/L de cloranfenicol. Todos los conteos fueron realizados por triplicado. Para esto se tomaron 10 g de las respectivas muestras de suelo y se suspendieron en 90 ml de solución salina al 0.85 %, se agitaron en vórtex por 10 min. A partir de 100 µl de la suspensión anterior se realizaron diluciones seriadas de 10-1 hasta 10-8. Las bacterias se incubaron a 25 °C durante 48 h y los hongos a temperatura ambiente de durante cinco – siete días. Se realizó conteo de células viables en las placas que contenían entre 30 y 300 UFC. Se realizó aislamiento y purificación de los morfotipos encontrados. Los diferentes morfotipos de bacterias y hongos aislados se caracterizaron macroscópicamente, microscópicamente, y usando marcadores moleculares. Para bacterias se determinó la secuencia del 16S del ADNr de acuerdo a los procedimientos de Lane (1991). Para los hongos se extrajo ADN con base en lo reportado por Melo et al. (2006), GEBIX (2009, 2010) y Płaza et al. (2004) y se usaron iniciadores ITS1 y ITS4 de acuerdo con el procedimiento descrito por Vargas et al. (2008) y GEBIX (2010). Las secuencias se analizaron mediante Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al. 1990, Benson et al. 2000) y utilizando Genius PRO 5.1.5.

Las bacterias aisladas se caracterizaron en tres niveles diferentes (macroscópicamente, microscópicamente y molecularmente). Para el análisis molecular se determinó la secuencia del 16S ADNr de acuerdo a los procedimientos de Lane (1991). Las secuencias obtenidas se analizaron mediante Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al. 1990, Benson et al. 2000) y utilizando Genius PRO 5.1.5. Las bacterias identificadas pertenecen a cuatro filos diferentes entre los que se encuentran: Bacteroridetes, Actinobacteria, Proteobacteria y Firmicutes. Así mismo se encuentran distribuidas en seis clases diferentes: Sphingobacteriia, Actinobacteria, Betaproteobacteria, Gammaproteobacteria, Bacilli y Alphaproteobacteria. Se identificaron nueve ordenes: Sphingobacteriales, Actinomicetales, Burkholderiales, Pseudomonadales, Bacillales, Enterobacteriales, Rhohospirillales, Xantomonadales y Rhizobiales. De igual forma se identificaron 19 familas: Sphingobacteriaceae, Streptomycetaceae, Micrococcaceae, Burkholderiaceae, Pseudomonaceae, Bacillaceae, Nocardiaceae, Paenibacillaceae, Moraxallaceae, Trichocomaceae, Rhizobiaceae, Santomonadaceae, Cellulomanadaceae, Micromonosporaceae, Comamonadaceae, Chitinophagaceae, Acetobacteraceae, Microbacteria y Enterobacteraceae. Se identificaron 25 géneros y 18 especies, entre los géneros se encuentran: Pedobacter, Streptomyces, Arthrobacter, Burkholderia, Pseudomonas, Paenibacillus, Bacillus, Rhodococcus, Brevibacillus, Acinetobacter, Kaisitia, Stentrophomonas, Oerskovia, Micromonospora, Sthaphylococcaceae, Oerskovia, Micromonospora, Sthaphylococcaceae, Enterobacter, Chitinophaga, Pantoea, Roseomonas, Leucobacter, Rahnella, Escherichia, Bionectria, Comamonas y Microbacterium. En las figuras se presenta la distribución de los niveles taxonómicos aislados para cada uno de los grupos funcionales: fijadores de nitrógeno (Figura 1), solubilizadores de fosfato (Figura 2) y celulolíticos (Figura 3).

1. Acinetobacter
   rank: genus
2. Arthrobacter
   rank: genus
3. Bacillus
   rank: genus
4. Brevibacillus
   rank: genus
5. Burkholderia
   rank: genus
6. Chitinophaga
   rank: genus
7. Comamonas
   rank: genus
8. Enterobacter
   rank: genus
9. Escherichia
   rank: genus
10. Kaistia
    rank: genus
11. Leucobacter
    rank: genus
12. Microbacterium
    rank: genus
13. Micromonospora
    rank: genus
14. Oerskovia
    rank: genus
15. Paenibacillus
    rank: genus
16. Pantoea
    rank: genus
17. Pedobacter
    rank: genus
18. Pedobacter
    rank: genus
19. Pseudomonas
    rank: genus
20. Rahnella
    rank: genus
21. Rhodococcus
    rank: genus
22. Roseomonas
    rank: genus
23. Staphylococcaceae
    rank: genus
24. Stentrophomonas
    rank: genus
25. Streptomyces
    rank: genus

Los hongos aislados se caracterizaron en tres niveles diferentes (macroscópicamente, microscópicamente y molecularmente). Para el análisis molecular se realizó extracción de ADN con base en lo reportado por Płaza et al. (2004), Melo et al.(2006) y GEBIX (2009, 2010) usando iniciadores ITS1 y ITS4 de acuerdo con el procedimiento descrito por Vargas et al. (2008) y GEBIX (2010). Las secuencias obtenidas se analizaron mediante Basic Local Alignment Search Tool (Altschul et al. 1990, Benson et al. 2000) y utilizando Genius PRO 5.1.5. Las hongos identificados pertenecen a cuatro Phylum diferentes entre los que se encuentran: Ascomycota, Zygomicota, Basidiomicota y Glomeromycota. Así mismo se encuentran distribuidos en ocho clases diferentes: Eurotiomycetes, Sordariomycetes, Zygomycetes, Dothideomycetes, Tremellomycetes, Leotiomycetes, Glomeromycetes y Mucormycotina. Se identificaron 12 ordenes: Eurotiales, Hypocrealesm, Saccaromycetes, Xilariales, Mortierellales, Pleosporales, Tremellales, Helotiales, Dothideales, Glomerales, Mucorales y Sordariales. De igual forma se identificaron 14 familas: Hypocraceae, Saccharomycetales, Amphisphariaceae, Mortierellaceae, Leptosphaeriaceae, Trichosporanaceae, Nectriaceae, Cordycipitaceae, Myxotrichaceae, Dothioraceae, Glomeraceae, Mucoraceae, Sporomiaceae y Sordariaceae. Se identificaron 23 géneros y 25 especies, entre los géneros se encuentran: Penicillium, Trichoderma, Torula, Truncatella, Mortierella, Hypocrea, Coniothyrium, Trichosporon, Neonectria, Leptosphaeria, Aureobasidium, Umbelopsis, Fusarium, Coniothyrium, Preussia, Aspergillus, Mucor, Diplogelasinospora y Drechselera. Las hongos identificados pertenecen a cuatro Phylum diferentes entre los que se encuentran: Ascomycota, Zygomicota, Basidiomicota y Glomeromycota. Así mismo se encuentran distribuidos en ocho clases diferentes: Eurotiomycetes, Sordariomycetes, Zygomycetes, Dothideomycetes, Tremellomycetes, Leotiomycetes, Glomeromycetes y Mucormycotina. Se identificaron 12 ordenes: Eurotiales, Hypocrealesm, Saccaromycetes, Xilariales, Mortierellales, Pleosporales, Tremellales, Helotiales, Dothideales, Glomerales, Mucorales y Sordariales. De igual forma se identificaron 14 familas: Hypocraceae, Saccharomycetales, Amphisphariaceae, Mortierellaceae, Leptosphaeriaceae, Trichosporanaceae, Nectriaceae, Cordycipitaceae, Myxotrichaceae, Dothioraceae, Glomeraceae, Mucoraceae, Sporomiaceae y Sordariaceae. Se identificaron 23 géneros y 25 especies, entre los géneros se encuentran: Penicillium, Trichoderma, Torula, Truncatella, Mortierella, Hypocrea, Coniothyrium, Trichosporon, Neonectria, Leptosphaeria, Aureobasidium, Umbelopsis, Fusarium, Coniothyrium, Preussia, Aspergillus, Mucor, Diplogelasinospora y Drechselera.

1. Aspergillus
   rank: genus
2. Aureobasidium
   rank: genus
3. Beauveria
   rank: genus
4. Bionectria
   rank: genus
5. Coniothyrium
   rank: genus
6. Diplogelasinospora
   rank: genus
7. Drechslera
   rank: genus
8. Fusarium
   rank: genus
9. Geomyces
   rank: genus
10. Hypocrea
    rank: genus
11. Leptosphaeria
    rank: genus
12. Mortierella
    rank: genus
13. Mucor
    rank: genus
14. Neonectria
    rank: genus
15. Paecilomyces
    rank: genus
16. Penicillium
    rank: genus
17. Preussia
    rank: genus
18. Torula
    rank: genus
19. Trichoderma
    rank: genus
20. Trichosporon
    rank: genus
21. Truncatella
    rank: genus
22. Umbelopsis
    rank: genus

El PNN Los Nevados se encuentra localizado en la Cordillera Central de Colombia, entre las vertientes oriental y occidental, con alturas entre los 2,600 y 5,321 m.s.n.m. (figura 4). Comprende un área aproximada de 58,300 hectáreas, en jurisdicción de los departamentos de Caldas (Municipio de Villamaría), Risaralda (Municipios de Santa Rosa de Cabal y Pereira), Quindío (Municipio de Salento) y Tolima (Municipios de Ibagué, Anzoátegui, Santa Isabel, Murillo, Villahermosa, Casabianca y Herveo) (PNNN 2007).